Guidelines für die Probenvorbereitung

Allgemeine Informationen

Benutzer die noch keine Proben zur Bearbeitung in der Massenspektrometrie Core Facility hatten, Benutzer von externen Instituten und Benutzer, die eine größere Anzahl von Proben bearbeiten lassen wollen, werden gebeten vor Abgabe der Proben mit der Massenspektrometrie Core Facility Kontakt aufzunehmen.

Für die erfolgreiche Identifikation von Proteinen aus Gelen empfehlen wir mindestens eine mit Coomassie Brilliant Blue färbbare Bande abzugeben. Silber gefärbte Banden können ebenfalls bearbeitet werden, aber auf Grund der geringen Proteinmenge, die in solchen Banden enthalten sind, ist mit einem erheblich schlechteren Ergebnis zu rechnen. Falls Silber gefärbte Gelstücke analysiert werden sollen, muss darauf geachtet werden, dass für die Färbung ein für die Massenspektrometrie geeignetes Färbeprotokoll verwendet wurde (Silberfärbung nach Blum).


Coomassie-gefärbte Gele

Wir empfehlen Gele mit Imperial Stain (Pierce) zu färben. Diese Färbung enthält keine Substanzen, die zu einer Modifikation von Peptiden führen kann.

  • Wenn möglich, die Probe vor der Auftrennug im SDS-Gel alkylieren (s. Protokoll). Dies erhöht die Sensitivität der Analyse.
  • Das Gel bitte entfärben, sodass ein klarer Hintergrund sichtbar ist.
  • Wenn Sie die Gelbanden selbst ausschneiden, bitte schicken Sie uns ein elektronisches Bild und markieren Sie die Position an der die Bande ausgeschnitten wurde (Wir benötigen das Bild um die Proteinmengen für die Analyse abschätzen zu können.)
  • Das Gel nicht länger als nötig in der Fixierungslösung liegen lassen, da ansonsten unspezifische Modifikationen der Proteine auftreten können.
  • Wenn Sie die Gelbanden selbst ausschneiden, die Banden mit möglichst wenig Gelmaterial ausschneiden.
  • Die Gelstücke bitte in ein sauberes Eppendorfgefäss überführen. (Zugabe von Wasser ist nicht notwendig.)

Silber gefärbte Gele

Wir empfehlen für die Analyse von Proteinen mindestens eine Bande, die mit Coomassie Brilliant Blue färbbar ist. Falls die Menge des isolierten Proteins unterhalb der Nachweisgrenze von Coomassie Brilliant Blue, versuchen Sie das Experiment heraufzuskaliern. Falls es nicht möglich ist die erforderliche Menge zu isolieren und es notwendig ist die Proteine mittels Silberfärbung anzufärben, bitte achten Sie darauf keine Silberfärbung zu verwenden die Formaldehyd oder Glutarladehyd im Fixierungsschritt einsetzt. Wir empfehlen die Färbemethode nach Shevchenko et al, (1996) Analytical Chemistry, 68:850-858 oder die hier beschriebene Färbemethode.