Kühn Lab

AG Kühn

iPS Zellbasierte Krankheitsmodellierung

Profil

Wie genetische Variation und Mutationen zur Entstehung menschlicher Krankheiten führen, ist eine wichtige Frage in der biomedizinischen Forschung und die Grundlage für die Entwicklung therapeutischer Interventionen.

Wir verwenden die CRISPR / Cas9-Nuklease-Technologie in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) als zentrale Technologie zur Untersuchung genetisch bedingter Krankheitsmechanismen. hiPSCs sind Zelllinien, die unbegrenzt vermehrt werden können, aber auch in vitro in viele Zelltypen des menschlichen Körpers differenziert werden können.

Die Forschungsgruppe zur hiPSC-basierten Krankheitsmodellierung richtet eine Technologieplattform ein, die das Engineering, die Differenzierung und die Phänotypisierung von hiPSCs ermöglicht. Das Labor konzentriert sich derzeit auf die Optimierung der CRISPR / Cas9-induzierten Mutagenese in hiPSCs und ihre gerichtete Differenzierung in dopaminerge Neuronen. Das erste Thema erfordert die effiziente Bereitstellung und Wirkung von Cas9-Nuklease, genspezifischen sgRNAs und maßgeschneiderten DNA-Reparatur-Template-Molekülen in hiPSCs. Im zweiten Arbeitsbereich definieren wir die optimale Kombination von externen und internen Signalen, die die Differenzierung von hiPSCs zu dopaminergen Neuronen spezifizieren, um genetische Läsionen zu untersuchen, die zum Verlust dieser Zellen bei der Parkinson-Krankheit führen.

Forschung

Genbearbeitung mit dem CRISPR / Cas Nuklease System

Programmierbare Nukleasen werden zum Editieren der Sequenz von Zielgenen durch Aufspaltung der DNA an vorgewählten Positionen verwendet. Die neueste Generation von Nukleasen wird durch das bakterielle Abwehrsystem CRISPR / Cas9 zur Verfügung gestellt, das kurze single guide (sg)-RNAs für die DNA-Sequenzerkennung verwendet und durch Adaption der ersten 20 Nukleotide der sgRNA auf neue Zielsequenzen programmiert werden kann. sgRNAs werden durch die generische Nuklease Cas9 gebunden und führen den Komplex zu der komplementären DNA-Sequenz, gefolgt von der Induktion eines Doppelstrangbruches (DSB). DSBs werden in Säugerzellen hauptsächlich durch den NHEJ-Reparaturweg fixiert, der offene DNA-Enden unpräzise wiederverbindet und häufig zum Verlust von mehreren Basenpaaren an der Zielstelle führt.

Solche kleinen Deletionen mit zufälliger Größe werden oft für die Erzeugung von Frame-Shift-Mutationen in codierenden Regionen verwendet, die zur Geninaktivierung (Knockout) führen. Die Erzeugung von präzisen Modifikationen, wie zum Beispiel das Ersetzen von Nukleotiden durch Gen-Targeting, erfordert den alternativen Weg der homologen gerichteten Reparatur (HDR), der neue Sequenzen von extern gelieferten DNA-Matrizen in die DSB-Stelle einlesen kann ("knock-in"). Nur ein kleiner Teil der DSBs in Säugetierzellen wird durch HDR repariert, was eine genaue Gen-Editierung ineffizient macht. Unter Verwendung von Reporterkonstrukten, die das Verhältnis von NHEJ oder HDR für die Reparatur von DSBs zeigen, fanden wir, dass die Suppression der NHEJ-Enzym-DNA-Ligase IV durch einen niedermolekularen Inhibitor oder durch adenovirale Proteine ​​ausreicht, um die DSB-Reparatur durch HDR zu stimulieren. Dieser Eingriff erleichtert die Einführung von Knock-in-Sequenzmodifikationen in Zelllinien und Mäusen, wie sie für die genaue Modellierung von Patienten-abgeleiteten Mutationen erforderlich sind. Darüber hinaus bilden diese und laufende Arbeiten zur aktiven Förderung von HDR eine Grundlage für die zukünftige Anwendung des CRISPR / Cas9-Systems in der somatischen Gentherapie.

Erforschung von Krankheitswegen durch Gen-Editierung in humanen IPS-Zellen

Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) sind frühe embryonale Zelllinien, die durch Differenzierung von z.B.  Hautfibroblasten durch Expression von Reprogrammierungsfaktoren etabliert werden können. hiPSCs können unbegrenzt vermehrt werden, aber auch in vitro zu wichtigen Zelltypen wie Neuronen oder Kardiomyozyten differenziert werden.

Durch die Kombination der hiPS-Zell- und CRISPR / Cas9-Nuklease-Technologien kann die biomedizinische Forschung menschliche Genotyp-Phänotyp-Beziehungen untersuchen. Die Nuklease-gestützte Assemblierung von Genotypen ermöglicht beispielsweise die Einführung von Risiko-Allelen für Parkinson-Kranke in "gesunde" genetische Hintergründe oder die Korrektur solcher Allele in patienten-abgeleiteten hiPS-Zellen. Für die phänotypische Analyse werden Mutanten- und Kontrollzellen unter Verwendung von linienspezifischen Transkriptionsfaktoren in differenzierte Zellen, wie dopaminerge Neuronen, umgewandelt. Die differenzierten Kulturen können durch Live-Cell-Imaging für krankheitsassoziierte Phänotypen untersucht werden, um letztendlich eine relationale Karte von Genotypen, Umwelttypen und Phänotypen zu erstellen.

Seit Herbst 2014 konzentrieren wir uns auf den Aufbau dieser hiPS-Zelltechnologie-Plattform für die simultane Modifikation von bis zu drei Genen (Multiplex-Engineering) durch Optimierung der Bereitstellung von Cas9-, sgRNA- und HDR-Templates in hiPSCs und zur Differenzierung von hiPSCs in dopaminerge Neuronen. Gegenwärtig erreichen wir in bis zu 30% der transfizierten hiPSCs die Mutagenese zweier Gene und können 1/3 der Zellen zu dopaminergen Neuronen differenzieren. Um die Analyse von Kulturen mittels Live Cell Imaging zu unterstützen, verwenden wir fluoreszierende Reporter, indem wir deren Expression mit der von Markergenen verknüpfen. Darüber hinaus wollen wir den Nutzen der hIPSC-Technologieplattform durch die Etablierung eines CRISPR / Cas9-basierten konditionalen, d.h. induzierbaren und zelltypspezifischen Genknockouts in differenzierten Zellen und die dreidimensionale Differenzierung von hiPSCs zu Organoiden erweitern, die Aspekte der fetalen Hirnentwicklung rekapitulieren.

Veröffentlichungen

Nachrichten

Dr. Ralf Kühn
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